【原理】

        试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物氟喹诺酮类和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氟喹诺酮类抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留氟喹诺酮类的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物氟喹诺酮类的含量。

【试剂盒技术指标】   

规       格：96孔/盒

灵 敏 度：0.5ppb

检测时间： 45min

交叉反应率：

环丙沙星（CIF）…………………………100％

恩诺沙星（ENR）…………………………75%

氧氟沙星（OFL）………………………… 99％

奥索利酸（OXO）………………………116％

达氟沙星（DAN）…………………………65％

诺氟沙星（NOR）……………………… 198％

洛美沙星（LOM）……………………… 86％

培氟沙星（PEF）…………………………56％

沙拉沙星（Sarafloxacin）……………190％

依诺沙星（ENO）…………………………98％

氟喹酸（FLU）…………………………… 96％

麻保沙星（MAR）……………………… 110％

氨氟沙星（AMI）…………………………98％

那氟沙星（NAD）…………………………56％

样本回收率：

组   织…………………………………80±15%

血   清…………………………………80±15%

蜂   蜜 ……………………………… 75±15%

氟喹诺酮类检测下限分别为：

环丙沙星（CIF） 检测下限…………………………0.5ppb

恩诺沙星（ENR）检测下限……………………约1ppb

氧氟沙星（OFL）检测下限………………………约0.5ppb

达氟沙星（DAN）检测下限………………………约1ppb

诺氟沙星（NOR）检测下限……………………约0.25 ppb

洛美沙星（LOM）检测下限………………………约0.5ppb

培氟沙星 （PEF）检测下限……………………约0.25ppb

沙拉沙星检测下限………………………………约0.55ppb

依诺沙星（ENO）检测下限………………………约0.5ppb

奥索利酸（OXO）检测下限………………………约0.5ppb

氟喹酸　（FLU）检测下限………………………约.5ppb

麻保沙星（MAR）检测下限………………………约0.5ppb

氨氟沙星（AMI）检测下限………………………约0.5ppb

那氟沙星（NAD）检测下限………………………约1ppb

【试剂盒组成】   

1、 微量测试孔：每条8孔，一板12条

2、 标准品溶液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.5ppb、1.5 ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

3、 高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶） 1ppm

4、 抗体工作液         7 ml …………………………… 绿色帽

5、 酶标记物             7 ml …………………………… 红色帽

6、 底物A液             7ml………………………………棕色帽

7、 底物B液　         7ml………………………………黑色帽

8、 终止液                  7ml………………………………黄色帽

9、 20X浓缩洗涤液40 ml ……………………………白色帽

10、 2X浓缩复溶液    50 ml ……………………………蓝色帽

【所用仪器、试剂】   

具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

试         剂：浓盐酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素钠

                     Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、

【实验前溶液配制】

配液1、0.1M HCL溶液  

860µl浓盐酸加去离子水100ml溶解。

配液2、乙腈-0.1MHCL溶液

V_乙腈：V_{0.1M –HCL} ＝ 84：16

配液3、乙腈-二氯甲烷混合溶液

V_乙腈-V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液4、pH7.2  0.05M PB缓冲液

12.9gNa₂HPO₄·12H₂O+2.175gNaH₂PO₄·2H₂O

             加去离子水1L溶解。

配液5、pH7.2   0.02MPB缓冲液

 5.16gNa₂HPO₄·12H₂O+0.87g NaH₂PO₄·2H₂O

 加去离子水1L溶解。

配液6、用去离子水将2X浓缩复溶液按1：1稀释

（1份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本复溶。

配液7：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19

               稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量

               配制洗涤液。

【样本前处理步骤】   

样本前处理须知    处理任何样本时，都必须注意：

（1）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾、蛋类等。

（2）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同试剂时要更换吸头。

（3）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a）组织/蛋类样本（鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼、蛋类等）

1、 称2.0±0.05g 均质样本于50ml离心管中；

2、 加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振荡5min，4000r/min以上，15℃离心10min；

3、 取4ml清澈有机相至干燥溶器中，56℃氮气吹干/旋转蒸发至干；

4、 用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃离心5min；

5、 去除上层取下层50µl液体用于分析。

         样本稀释倍数：1

（b） 组织/蛋类低检测限处理方法二

1、称取2.0±0.05g均质过的组织样本于50ml离心管中；加入4ml 0.02M  PB缓冲液，充分振荡2min，于15℃，4000r/min以上速度离心10min

2、取50µl液体与450µl稀释后的复溶液

2、取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：20倍

（c）血清样本的处理

1、 用加有肝素钠（20-30单位/ml血）的离心管采集血样本（建议采血注射器也用肝素钠润洗），血样本室温静置1h，待析出血浆后4000r/min以上，15℃离心10min，取出血浆1ml；

2、 加入乙腈（无水）4ml上下充分混合5min，4000r/min以上，15℃离心10min；

3、 移上清至另一离心管中，加入2ml 0.02M PB缓冲液，混匀；

4、 加入二氯甲烷5ml，充分混匀5min，4000r/min，15℃离心10min，去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干/氮气吹干；

5、 用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃离心5min；

6、 轻吸掉上层和中间白色杂质，取下层相100µl加入100µl稀释后的复溶液，混合30s；

7、 取50µl用于分析。

        样本稀释倍数：2

（d）蜂蜜高检测限发法方法

1、 取1g蜂蜜，加６ml乙腈-0.1MHCL溶液振荡至蜂蜜全部溶解；

2、 加入３ml 0.05M PB缓冲液，加入11ml二氯甲烷，振荡5min，4000r/min以上离心5min；

3、 轻吸掉上层，取下层有机相８ml至干燥溶器中，56℃氮气吹干；

4、 用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，再加入正己烷1ml混合30s，3000r/min以上，15℃离心5min；

5、 去除上层取下层50µl液体用于分析。

        稀释倍数：2

（e）蜂蜜低检测限发法方法

1、 称取2±0.05g蜂蜜样本于50ml离心管中，加入4ml 0.02M  PB缓冲液充分振荡2min，；

2、 取50µl与950µl已稀释好的复溶液复溶，混合30s；

3、 取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：40倍

（f）牛奶

1、取出50μl 牛奶于另一试管中，加入1950μl样本稀释液混30s；

2、取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：40倍 

【酶标免疫分析程序】   

操作步骤：

1、 将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷冻。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品均需做2孔平行，并记录标准孔的样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl /孔，然后加酶标记物50μl/孔,再加入50µl/孔抗体工作液。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。

5、 取出用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测在5min内读完数据），测定吸光度值（OD值）。

【结果判定】   

      结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与氟喹诺酮类的含量成负相关。

1、粗略判定

用样本的平均吸光度值与标准品比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.238， 样本2的吸光度值为0.946，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.845；0.5ppb为1.542；1.5ppb为1.130； 4.5ppb为0.635；13.5ppb为0.326； 40.5ppb为0.156。则样本1的浓度范围是13.5ppb-40.5ppb；样本2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟喹诺酮类的实际浓度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以氟喹诺酮类标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟喹诺酮类的实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

3、标准准曲线：

图1：氟喹诺酮检测试剂盒的回归曲线

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出喹诺酮检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应喹诺酮浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】   

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒*佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。

原创作者：上海臻科生物科技有限公司